人—心脏组织细胞悬液制备

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以上 |  以下操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。

心脏组织背景介绍

心脏是一中空的肌性器官，是血液循环的动力器官，主要由心肌构成，有四个腔，包括：左心房、左心室、右心房、右心室，左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜，这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，细胞之间有闰盘结构，该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接。心肌细胞之间细胞外基质成分的分布和排列是一个多层次、多方位的网络结构，称为心肌基质网络。这个网络结构主要由心肌纤维间隙中的成纤维细胞合成和分泌的I型和III型胶原蛋白形成的纤维组成，其中大部分是I型胶原蛋白形成的粗纤维，伸展和回弹性较小，而III型胶原蛋白形成的细纤维伸展和回弹性均较大。这两种纤维组成的网络不仅包绕每个心肌细胞，也连接相邻的心肌细胞、心肌细胞群和毛细血管。

综上，心脏组织含大量胶原蛋白，本次解离主要使用罗氏Liberase TL酶，其中含胶原酶和中性蛋白酶，可提高心脏组织解离的质量和可重复性，并提高细胞活力和功能。此外，心脏细胞解离时多建议抽核，主要原因是成体心肌细胞体积大（长杆状，长100-150 μm, 宽20~30 μm）， 远超过常规体细胞（近球形，直径<30 μm），目前主流的商用单细胞平台都难以捕获此类大细胞。

心脏组织示意图

材料和试剂耗材

1、试剂耗材

2、溶液配制

实验流程

1. 将组织转移到含有 1 mL DPBS的培养皿中，在不损坏心包层的情况下小心地清除脂肪等非目标组织。
2. 使用手术刀将组织切碎成大约2 mm的小块，大约200 mg。
3. 切碎的组织转移到装有消化缓冲液的1.5 mL EP管，尽量减少DPBS带入，用封口膜密封EP管。
4. 将EP管放入水浴中，并在37℃下搅拌消化15 min，每5 min从水浴中取出并用手轻轻摇晃。
5. 消化完成后，将EP管放在冰上，并用5 mL移液管吹打。上下吹打 5-10 次。
6. 通过100 µm细胞过滤器过滤溶液。使用1 mL柱塞通过过滤器轻轻搅动组织。用8.5 mL DMEM洗涤过滤器至终体积为10 mL的细胞悬液。
7. 如果样品加到Chromium控制器中，则使用70 µm滤膜过滤溶液，用另外5 mL DMEM 清洗滤膜。
8. 300 g，4℃离心5 min。
9. 弃去上清液，用10 mL DPBS + 2 % FBS清洗沉淀，加入2.86 mL Percoll 溶液，制成27 % Percoll-cell 溶液，将溶液转移到高速离心管中并准备平衡管。
10. 在4℃下以15000 g离心20 min，中断选项设置为4（或减速）。
11. 使用1 mL移液器收集细胞，在DPBS + 0.04 % BSA中清洗细胞，并重悬在100 μL DPBS + 0.04 % BSA中。
12. 取适量悬液加入染色缓冲液（AO/PI或者台盼蓝）评估细胞活力，调整浓度并继续执行10X操作 。

心脏组织解离大多情况需抽核，核分离流程如下：

1. 从储藏室中取出切碎的组织并置于干冰上。
2. 将组织块转移到预冷的Dounce匀浆器 （7 mL）中并加入3 mL HB。用松杵8次敲击和紧杵8次敲击均质。保持在冰上以避免加热。如果均质化不完全，需添加敲击次数（取决于组织的数量）。
3. 将匀浆的组织通过40 μm细胞过滤器过滤到50 mL管中，用2× 1 mL额外的 HB清洗均质器。
4. 在4℃下，以500 g离心5 min以获得细胞核沉淀，完全去除上清液。
5. 将细胞核沉淀重新悬浮在1 mL SB中，用2滴 NucBlue 染色悬浮液，等待10 min染色。
6. 继续进行流式细胞仪分选到带有200 μL SB 的 EPPi管中，设置gates以选择DAPI染色的细胞核。排除小于1 µm的颗粒，以去除小碎片和损坏的原子核，排除双峰和不规则形状的碎片。
7. 将分选的细胞核以500 g的速度在4℃下离心5 min以获得颗粒，完全去除上清液，在100 μL SB中重悬。
8. 使用Countess和台盼蓝对细胞核进行4次计数。调整浓度并继续加载到10X芯片。

结果展示

注：心脏组织细胞较大，一般采用抽核解离。

往期回顾

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